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La nuova mappa basata su CRISPR lega ogni gene umano alla sua funzione

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I dati per una nuova mappa della funzione genica sono disponibili per l’utilizzo da parte di altri scienziati. “È una grande risorsa nel modo in cui il genoma umano è una grande risorsa, in quanto puoi entrare e fare ricerca basata sulla scoperta”, afferma il professor Jonathan Weissman. Credito: Jen Cook-Chrysos/Whitehead Institute

Il Progetto Genoma Umano è stata un’iniziativa ambiziosa per sequenziare ogni frammento di DNA umano. Il progetto ha riunito collaboratori di istituti di ricerca di tutto il mondo, tra cui il Whitehead Institute for Biomedical Research del MIT, ed è stato finalmente completato nel 2003. Ora, oltre due decenni dopo, il professor Jonathan Weissman e colleghi del MIT sono andati oltre la sequenza per presentare il primo mappa funzionale dei geni che sono espressi nelle cellule umane. I dati di questo progetto, pubblicati online il 9 giugno a Cellulalega ogni gene al suo lavoro nella cellula ed è il culmine di anni di collaborazione sul metodo di sequenziamento unicellulare Perturb-seq.

I dati sono disponibili per l’utilizzo da parte di altri scienziati. “È una grande risorsa nel modo in cui il genoma umano è una grande risorsa, in quanto puoi entrare e fare ricerca basata sulla scoperta”, afferma Weissman, che è anche membro del Whitehead Institute e ricercatore presso l’Howard Hughes Medical Istituto. “Invece di definire in anticipo quale biologia guarderai, hai questa mappa delle relazioni genotipo-fenotipo e puoi entrare e schermare il database senza dover fare alcun esperimento”.

Lo schermo ha permesso ai ricercatori di approfondire diverse questioni biologiche. Lo hanno usato per esplorare gli effetti cellulari di geni con funzioni sconosciute, per studiare la risposta dei mitocondri allo stress e per selezionare i geni che causano la perdita o l’acquisizione di cromosomi, un fenotipo che si è rivelato difficile da studiare in passato. “Penso che questo set di dati consentirà tutti i tipi di analisi che non abbiamo ancora nemmeno pensato da parte di persone che provengono da altre parti della biologia, e all’improvviso hanno solo a disposizione questo su cui attingere”, afferma Tom, ex postdoc del Weissman Lab Norman, co-autore senior del giornale.

Il pionieristico Perturb-seq

Il progetto sfrutta l’approccio Perturb-seq che consente di seguire l’impatto dell’attivazione o della disattivazione dei geni con una profondità senza precedenti. Questo metodo è stato pubblicato per la prima volta nel 2016 da un gruppo di ricercatori tra cui Weissman e il collega professore del MIT Aviv Regev, ma poteva essere utilizzato solo su piccoli insiemi di geni e con grandi spese.

La massiccia mappa Perturb-seq è stata resa possibile dal lavoro fondamentale di Joseph Replogle, un MD-Ph.D. studente nel laboratorio di Weissman e co-primo autore del presente articolo. Replogle, in collaborazione con Norman, che ora conduce un laboratorio al Memorial Sloan Kettering Cancer Center; Britt Adamson, assistente professore presso il Dipartimento di Biologia Molecolare dell’Università di Princeton; e un gruppo di 10x Genomics, ha deciso di creare una nuova versione di Perturb-seq che potesse essere ridimensionata. I ricercatori hanno pubblicato un documento di prova di concetto in Biotecnologie della natura nel 2020.

Il metodo Perturb-seq utilizza la modifica del genoma CRISPR-Cas9 per introdurre cambiamenti genetici nelle cellule, quindi utilizza il sequenziamento dell’RNA unicellulare per acquisire informazioni sugli RNA espressi risultanti da un determinato cambiamento genetico. Poiché gli RNA controllano tutti gli aspetti del comportamento delle cellule, questo metodo può aiutare a decodificare i numerosi effetti cellulari dei cambiamenti genetici.

Sin dal loro primo documento di prova concettuale, Weissman, Regev e altri hanno utilizzato questo metodo di sequenziamento su scale più piccole. Ad esempio, i ricercatori hanno utilizzato Perturb-seq nel 2021 per esplorare come i geni umani e virali interagiscono nel corso di un’infezione da HCMV, un comune herpesvirus.

Nel nuovo studio, Replogle e collaboratori, tra cui Reuben Saunders, uno studente laureato nel laboratorio di Weissman e co-primo autore dell’articolo, hanno ampliato il metodo all’intero genoma. Utilizzando linee cellulari di cancro del sangue umano e cellule non cancerose derivate dalla retina, ha eseguito Perturb-seq su oltre 2,5 milioni di cellule e ha utilizzato i dati per costruire una mappa completa che lega i genotipi ai fenotipi.

Approfondire i dati

Dopo aver completato lo schermo, i ricercatori hanno deciso di utilizzare il loro nuovo set di dati ed esaminare alcune domande biologiche. “Il vantaggio di Perturb-seq è che ti consente di ottenere un grande set di dati in modo imparziale”, afferma Tom Norman. “Nessuno sa del tutto quali sono i limiti di ciò che puoi ottenere da quel tipo di set di dati. Ora, la domanda è: cosa ci fai effettivamente?”

La prima e più ovvia applicazione è stata quella di esaminare i geni con funzioni sconosciute. Poiché lo schermo legge anche i fenotipi di molti geni noti, i ricercatori potrebbero utilizzare i dati per confrontare i geni sconosciuti con quelli noti e cercare risultati trascrizionali simili, il che potrebbe suggerire che i prodotti genici abbiano lavorato insieme come parte di un complesso più ampio.

Spicca in particolare la mutazione di un gene chiamato C7orf26. I ricercatori hanno notato che i geni la cui rimozione ha portato a un fenotipo simile facevano parte di un complesso proteico chiamato Integratore che ha svolto un ruolo nella creazione di piccoli RNA nucleari. Il complesso dell’integratore è composto da molte subunità più piccole – studi precedenti avevano suggerito 14 singole proteine ​​- ei ricercatori sono stati in grado di confermare che C7orf26 costituiva un 15° componente del complesso.

Hanno anche scoperto che le 15 subunità lavoravano insieme in moduli più piccoli per svolgere funzioni specifiche all’interno del complesso dell’integratore. “In assenza di questa visione alta trecento metri della situazione, non era così chiaro che questi diversi moduli fossero così funzionalmente distinti”, afferma Saunders.

Un altro vantaggio di Perturb-seq è che, poiché il test si concentra su singole cellule, i ricercatori potrebbero utilizzare i dati per esaminare fenotipi più complessi che si confondono quando vengono studiati insieme ai dati di altre cellule. “Spesso prendiamo tutte le cellule in cui viene abbattuto il ‘gene X’ e le facciamo una media insieme per vedere come sono cambiate”, afferma Weissman. “Ma a volte quando si abbatte un gene, cellule diverse che stanno perdendo lo stesso gene si comportano in modo diverso e quel comportamento può essere mancato in media”.

I ricercatori hanno scoperto che un sottoinsieme di geni la cui rimozione ha portato a risultati diversi da cellula a cellula era responsabile della segregazione cromosomica. La loro rimozione stava causando la perdita di un cromosoma o l’acquisizione di un cromosoma da parte delle cellule, una condizione nota come aneuploidia. “Non si poteva prevedere quale fosse la risposta trascrizionale alla perdita di questo gene perché dipendeva dall’effetto secondario di quale cromosoma si otteneva o si perdeva”, dice Weissman. “Ci siamo resi conto che potevamo quindi ribaltare la situazione e creare questo fenotipo composito cercando le firme dei cromosomi acquisiti e persi. In questo modo, abbiamo eseguito il primo screening dell’intero genoma per i fattori necessari per la corretta segregazione del DNA. “

“Penso che lo studio delle aneuploidie sia l’applicazione più interessante di questi dati finora”, afferma Norman. “Cattura un fenotipo che puoi ottenere solo usando una lettura a cella singola. Non puoi seguirlo in nessun altro modo”.

I ricercatori hanno anche utilizzato il loro set di dati per studiare come i mitocondri hanno risposto allo stress. I mitocondri, che si sono evoluti da batteri a vita libera, trasportano 13 geni nei loro genomi. All’interno del DNA nucleare, circa 1.000 geni sono in qualche modo correlati alla funzione mitocondriale. “Le persone sono interessate da molto tempo al modo in cui il DNA nucleare e mitocondriale sono coordinati e regolati in diverse condizioni cellulari, specialmente quando una cellula è stressata”, afferma Replogle.

I ricercatori hanno scoperto che quando hanno perturbato diversi geni correlati ai mitocondri, il genoma nucleare ha risposto in modo simile a molti diversi cambiamenti genetici. Tuttavia, le risposte del genoma mitocondriale erano molto più variabili.

“C’è ancora una questione aperta sul perché i mitocondri abbiano ancora il loro DNA”, ha detto Replogle. “Un quadro generale del nostro lavoro è che uno dei vantaggi di avere un genoma mitocondriale separato potrebbe essere la regolazione genetica localizzata o molto specifica in risposta a diversi fattori di stress”.

“Se hai un mitocondri rotto e un altro rotto in un modo diverso, quei mitocondri potrebbero rispondere in modo differenziato”, afferma Weissman.

In futuro, i ricercatori sperano di utilizzare Perturb-seq su diversi tipi di cellule oltre alla linea cellulare cancerosa in cui hanno iniziato. Sperano anche di continuare a esplorare la loro mappa delle funzioni geniche e sperano che altri facciano lo stesso. “Questo è davvero il culmine di molti anni di lavoro da parte degli autori e di altri collaboratori, e sono davvero lieto di vederlo continuare ad avere successo ed espandersi”, afferma Norman.


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